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近日，美国化学会旗下期刊《ACS Nano》（IF = 17.1）在线发表了本研究组与生物治疗全国重点实验室包锐研究员、麻醉科柯博文教授的最新研究成果“Direct and Continuous Monitoring of Multicomponent Antibiotic Gentamicin in Blood at Single-Molecule Resolution”的研究文章，为单分子水平的活体生物连续监测提供了新的思路。 生物体液中小分子的即时监测对于临床诊断和治疗至关重要。然而，小分子固有的低识别度和生物体液的复杂成分给当前的检测技术带来了重大挑战。基于纳米孔的小分子分析方法已表现出卓越的分子分辨率和灵敏度，但由于药物所处的血液环境成分复杂，使用纳米孔直接和实时检测活体血液中药物目前仍有挑战。该团队使用铜绿假单胞菌的小电导机械敏感通道（PaMscS）来直接检测和快速定量10 nM至10 μM范围内的庆大霉素，并结合神经网络（CNN）精确区分了庆大霉素的三个主要成分。 PaMscS纳米孔具有独特的“分子筛”结构，可在检测6%全血样本时保持稳定的开放状态，该特性使PaMscS用于对全血样本免前处理的直接检测成为可能。与广泛采用的监测技术LC-MS相比，它显着降低了操作门槛，缩短了检测时间，并降低了成本。进一步，基于PaMscS构建的连续监测装置实现了活体大鼠体内庆大霉素约2.5小时的连续监测，无需消耗血液，同时可以对药物成分进行原位分析。该技术能够实现快速、便捷的单分子水平分辨率的药物监测，为今后临床用药的快速、实时、便捷检测，及实时连续检测提供了技术路线和潜在产品方案。 四川大学华西医院博士后赵长健、研究生王裕、陈晨、朱益波和苗壮为本文共同第一作者。

3月5日，本研究组与华西第二医院陈路团队合作，在Nature Methods期刊发表了题为“Real-time detection of 20 amino acids and discrimination of pathologically relevant peptides with functionalized nanopore”的研究论文。阐明纳米孔单分子检测新策略，实现了对全部20种天然氨基酸的直接区分，提出并验证了纳米孔外切酶实时多肽测序（Nanopore Exopeptidase Real-time Peptide Sequencing, NEPS）方法，为实现单分子蛋白质测序提供了可行途径，展示出生物传感器技术与人工智能算法结合的优异潜力。 图1.耿佳、陈路（左四、左五）与主要作者合影（左至右：陈山川、张丹、张明、王紫纯、唐超）。摄影：谢忱 每个人体内都有超过百万种蛋白质，与水、脂肪和无机物等共同构成生物体。蛋白质是生命活动的主要承担者，例如胰岛素和胰高血糖素控制血糖高低；视紫质能够感应光子，对于正常视觉功能必不可少。许多疾病的发生与蛋白质的异常直接相关，例如缺乏凝血因子会引起血友病；异常淀粉样蛋白斑可损害神经元，是阿尔茨海默病的潜在诱因。破译蛋白质信息是探索生命现象、促进人类健康的关键一环。蛋白质由20种氨基酸组成，其复杂程度远超仅由4种核苷酸组成的核糖核酸或者脱氧核糖核酸，因此对蛋白质进行测序的难度堪称破译“生命天书”。当前蛋白质测序的金标准是质谱测序法，但窄检测动态范围、短读长、复杂操作、昂贵价格等局限仍亟需突破。因此探索快速、实时、准确、便捷的蛋白质测序新技术是当前全球生物技术与医药领域共同关注的焦点与热门领域。 图2. 纳米孔实时检测多肽水解后的氨基酸 单分子技术可在单个分子灵敏度水平实时提供待检测物信息。近年来单分子蛋白质测序领域进展不断涌现，利用纳米孔技术已可直接区分20种氨基酸，但基于实时监测单个氨基酸分子的多肽水解测序仍待探索。该团队开发的NEPS技术首先通过在耻垢分枝杆菌孔蛋白A的孔道最窄处构建铜离子结合位点，使得氨基酸可与铜离子-纳米孔蛋白复合物结合，从而产生特异性电流信号。不同氨基酸的电流信号可被机器学习算法准确区分。该方法实现了全部20种天然氨基酸的高灵敏度、无修饰直接检测，且可拓展用于翻译后修饰氨基酸和非天然氨基酸的传感。进一步，结合多肽外切酶，实时监测多肽水解反应。水解产生的单氨基酸信号丰度大小与氨基酸在多肽序列中的位置信息有显著相关性，可用于推测多肽序列。同时，NEPS技术还被验证可识别和区分与肿瘤和阿兹海默症等疾病相关的10种多肽。 图3.第一作者张明在单分子蛋白质测序国际会议报告相关进展 NEPS技术为最终破译“生命天书”、更精准的疾病诊断和治疗、更快的药物开发提供有力工具，同时代表我国生物传感技术与蛋白组学工具的原始创新能力进入全球前沿方阵。我校华西医院生物治疗全国重点实验室耿佳研究员、华西第二医院陈路研究员为本文共同通讯作者；四川大学研究生张明、博士后唐超、研究生王紫纯和陈山川为该论文的共同第一作者。该项研究获得国家重点研发计划“智能传感器”重点专项、四川省科技厅、四川大学华西医院135计划等项目资助支持。